一、检测前准备‌

1. ‌试剂回温‌
检测前1小时将所有试剂（酶标板、标准品、抗体等）从4℃取出，置于室温（20~25℃）平衡，使用前需摇匀液体试剂‌。

2. ‌洗涤液配制‌
将20×浓缩洗涤液按1:19比例用蒸馏水稀释（如1mL浓缩液+19mL水），若有结晶需37℃加热溶解‌。

3. ‌样本前处理‌

1. ‌谷物/饲料‌：粉碎样品过20目筛，称取5.0g加入25mL提取液（80%甲醇水溶液），振荡3分钟，静置后取1mL上清液离心（4000rpm，2分钟）‌。

2. ‌液体样本‌：取1mL样品与9mL稀释液混合，离心后取上清‌。

3. ‌提取液稀释‌：按1:10比例稀释上清液（如100μL上清液+1000μL稀释液）‌。

二、检测步骤‌

1. ‌加样与反应‌

1. 在预包被抗原的酶标板微孔中依次加入：

1. 50μL标准品/处理后的样本（平行双孔）‌；

2. 50μL酶标记物（HRP标记竞争抗原）‌；

3. 50μL抗体工作液‌。

2. 室温（25℃）避光孵育30分钟‌。

2. ‌洗板‌
倒掉孔内液体，用稀释后的洗涤液注满微孔，静置30秒后甩干，重复5次，最后一次拍干残留液体‌。

3. ‌显色与终止‌

1. 每孔加入100μL TMB底物（A液+B液等体积混合），避光孵育5~10分钟（显蓝色）；

2. 加入100μL终止液（2M硫酸），溶液变黄色，立即用酶标仪在450nm波长读取OD值‌。

三、结果计算‌

1. ‌标准曲线制作‌
以标准品浓度（0ppb、5ppb、10ppb、20ppb、50ppb、150ppb）为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制半对数曲线‌。

2. ‌样本浓度计算‌
根据样本OD值从标准曲线计算浓度，再乘以稀释倍数（如谷物样本通常稀释20倍）‌。

四、注意事项‌

1. ‌温度控制‌
全程保持室温（20~25℃），温度过高或过低影响显色灵敏度‌。

2. ‌操作时效性‌

1. 酶标板开封后需1小时内使用；

2. 终止反应后10分钟内完成读数‌。

3. ‌安全防护‌
终止液含强酸，避免接触皮肤；标准品含毒素，操作时戴手套‌。

4. ‌结果验证‌
阳性样本需用色谱法等确证。